为什么read1和read2前几个碱基的错误率较高？

测序仪先测完read1全长，才跳转测read2，测序仪自身在刚启动或关闭时不太稳定，图像识别质量比较差，尤其是第一个碱基与最后一个碱基，测序质量最差，紧挨着的几个碱基测序质量也偏高，一是测序仪从刚开始的不稳定到稳定，有一个过渡的过程。另外接头空载，也会导致错误率上升。(ILLUMILA工程师的说法)

针对目前转录组及lncRNA的分析，我们的信息搜集表大部分都是针对的是两个组别两个样品之间的差异分析，但是对于一些实验设计，两两比较往往不能满足老师的分析要求。比如有的老师会做一个持续时间变化的实验设计，两两比较可以比较两个时间点的差异基因，但是对于一个持续时间段的差异基因的变化。又比如医口项目，老师有几对样品。正常和病变的，两两比较可以看出两个样本之间的差异，但是对于正常和病变两类之间差异比较，也可以选择其他统计学比较检验方式。下面就根据我个人做过的项目售后和个性化的经验，讲解一下曾经用过的几种差异比较的方式;

RNA-seq定量得到每个基因或转录本原始的readcount值，除了基因真实表达水平，readcount值还受到其它因素的影响，主要是基因长度和测序深度，所以不能对其进行直接比较。举个例子，比较样本A中基因a与基因b的表达水平，如果基因a的原始readcount值为2000，基因b的原始readcount值为1000，能说基因a的表达水平比基因b的表达水平高吗？（先不考虑是否显著差异）不能！由于是同一个样本，可以不考虑测序深度带来的影响，但还有基因长度因素，在基因a和基因b都表达一份的情况下，两个基因转录后的mRNA被随机打断成一定长度的片段，基因长度越长，那打断的片段就越多，最终落在长度长的基因上的reads就越多。