RNA-seq定量得到每个基因或转录本原始的readcount值，除了基因真实表达水平，readcount值还受到其它因素的影响，主要是基因长度和测序深度，所以不能对其进行直接比较。举个例子，比较样本A中基因a与基因b的表达水平，如果基因a的原始readcount值为2000，基因b的原始readcount值为1000，能说基因a的表达水平比基因b的表达水平高吗？（先不考虑是否显著差异）不能！由于是同一个样本，可以不考虑测序深度带来的影响，但还有基因长度因素，在基因a和基因b都表达一份的情况下，两个基因转录后的mRNA被随机打断成一定长度的片段，基因长度越长，那打断的片段就越多，最终落在长度长的基因上的reads就越多。如果基因a的长度为20000，基因b的长度为1000，那实际上基因b比基因a的表达水平要高得多。再比较基因a在样本A和样本B之间的表达水平，由于是同一个基因在不同样本间的比较，可以不考虑基因长度的影响。如果基因a在样本A中的原始readcount值为2000，在样本B中的原始readcount值为4000，那能说基因a在样本B中的表达水平高吗？不能！如果样本A被测了10M的reads，样本B被测了20M的reads，在理想情况下，基因a在样本A和样本B中的表达水平应该是相当的。当然，这是在理想的情况下，实际上，随着测序数据量的增加，所有基因的readcount值并不会严格按照数据量增加的比例增加，往往是高表达的基因（如管家基因）在疯狂增长，而低表达基因增长很少，如果用常规方法校正测序深度的影响，即每个基因在各样本中的readcount值除以各样本所有基因的reads总和，那一些高表达基因，实际上在处理和对照间没有差异，就有可能被这种校正方法假阳性低认为是上调表达。一些实际上没有差异的低表达基因，就有可能被假阳性地认为是下调表达。

不同标准化方法及应用软件

CPM

Counts per million的缩写，只对测序深度进行校正，一般差异分析都是比较同一基因在处理和对照间的表达差异，所有只做差异分析的话，校正到测序深度就足够了，因为同一个基因在不同样本间的长度都是一样的。常规的计算方法是某个基因的readcount值除以各样本总文库大小或是总的mapped reads数，然后乘以10的6次方（不这样处理的话，数字很小，不方便后面的处理和可视化）。举例来说，某个基因在样本A中的readcount值为1000，在样本B中的readcount值为1500，样本A的总reads数为10M，样本B的总reads数为15M，那该基因在样本A中的CPM值就为100，在样本B中的CPM值也为100。上面说过，这种常规的方法只在理想的情况下适用，实际上，在测得各基因达到饱和的情况下，随着测序深度的增加，各基因的丰度往往不是均匀增加，而是少部分的高表达基因（如管家基因）疯狂增长。这种常规方法计算出的CPM值用来进行差异分析，假阳性会很高。

由于常规方法存在缺陷，学者们提出了一些改进的方法，一种是除以处理和对照中所有样本reads数的上四分位数或中位数，这种方法虽然有了一些改进，但仍然存在一些缺陷。DESeq和edgeR两个软件包提供了另一种相近的方法，它们都基于大部分基因不差异假设，这大部分不差异基因的readcount值比较接近，ratio值接近1，DESeq校正方法选取ratio值的中位数，对每个lane的数据计算一个标准化因子，利用标准化因子校正原始的readcount值（没有进行CPM的转化），对标准化后的readcount值进行差异分析（注意DESeq2的logfolchang计算采用收缩估计模型）edgeR对每个样本都计算一个标准化因子，根据这个标准化因子可以计算每个样本的有效文库大小（也就是总reads数），再计算CPM值进行差异分析。

RPKM/FPKM

RPKM/FPKM是在CPM的基础上，又对基因长度进行了校正处理，这样既可以横向比较某个基因在不同样本间的表达情况，又可以纵向比较同一个样本内不同基因的表达情况（改进后的计算方法），RPKM和FPKM的区别在于，RPKM是针对于单端测序，FPKM是针对于双端测序，R代表reads，F代表fragment。因为在RPKM这个概念提出来的时候，还只有单端测序，后来双端测序出现，RPKM跟着升级为FPKM。这里要注意，同一个文库，双端测序跟单端测序所测得的片段数是一样的，只不过在单端测序中，这个片段就是一个read，而在双端测序中，是由小read1和小read2共同确立的一个read（为了和单端区别，通常叫它fragment），read1是这个fragment的左边一小部分，read2是这个fragment的右边一小部分，这样在比对的时候，通过两者的结合来确定这个fragment的位置，能提高精准度。所以RPKM和FPKM只是一个read和一个fragment概念上的区别，计算方法是相同的（如果比对时过滤read1和read2不同时mapping上的片段）。

常规的计算方法是基因的readcount值除以该样本的总reads数以及基因长度，再乘以10的9次方（和之前一样，不这样处理的话，RPKM/FPKM的值会非常小，不方便后续的处理和可视化。），改进后的计算方法在总reads数的处理上与改进后的CPM计算方法类似，在此基础上，还有对基因长度进行改进的方法，即除以有效基因长度，有效长度是指那些完全落在转录本上的fragment，所有可能的起始位点之和，计算方法是转录本长度减去fragment均值加1。

TPM

TPM（Transcripts per million）最早是由RSEM作者提出来的，和RPKM/FPKM类似，但不同于FPKM的是，TPM先对基因长度进行校正，再对测序深度进行校正，具体算法是，某个readcount值除以有效长度得到一个RPK值，再除以所有基因RPK值的总和，再乘以10的6次方。显然，在乘以10的6次方之前，样本内所有基因的TPM值之和应该等于1，乘以10的6次方，是为了让数据更好处理和可视化，当然，意义也就变成了每测1M的fragment，便有相应比例的fragment支持该转录本。也就说，在不同样本中，TPM值总和都是固定的10的6次方，而RPKM和FPKM并非如此，提出RPM概念的作者，也觉得TPM在比较不同样本间基因的表达更有优势（尽管不应该这么做）。

总结

CPM，RPKM/FPKM TPM都是描述基因相对表达水平的值，不能说是标准化方法，得到这些值的过程，才叫方法。
在进行差异分析时，关键是对测序深度的校正，DESeq2是直接用校正后的readcount值进行差异分析，edgeR是用校正后的readcount值转换成CPM值进行差异分析，但一般都不会校正基因长度再进行差异分析（低表达的基因效力会降低。）